Introducción

El empleo de disruptores de membrana es una nueva estrategia para control de hongos superiores. Su principio de acción está basado en los diferenciales de constitución de las paredes celulares de hongos y plantas. Su origen se remonta a los métodos de disrupción celular en biotecnología, usados para lisar –destruir de forma controlada– células en procesos industriales, con el objetivo de separar o purificar productos sintetizados por organismos unicelulares, sin alterar las propiedades de las moléculas extraíbles.

Enmarcado en el manejo integrado de enfermedades en vegetales, el objetivo de este artículo es presentar una herramienta nueva, en proceso de solicitud de clasificación por el comité de acción para la resistencia a fungicidas (FRAC, por sus siglas en inglés). Esta nueva herramienta se categoriza como bioprotector ya que destruye células fúngicas por plasmólisis y disfunción de Liasas, mientras que tonifica y fortifica las células vegetales. Las marcas del producto para Colombia son Forwin®, con registro como nutriente foliar, y Lichtor® en proceso de registro como biofungicida. Su descubrimiento, diseño y producción es el resultado de años de investigación por parte de la empresa de biotecnología Biogen Agro SAC de Perú, a la vez que la representación en el país está en manos de Talex – Colombia; ambas empresas pertenecientes al grupo corporativo TQC, con casa matriz en Lima (Perú).

Dentro del alcance del documento está la presentación de las bases fisiológicas del mecanismo de acción de Forwin® como bioprotector; es decir, su efecto deletéreo en los patógenos, en contraste con los beneficios y total selectividad hacia los cultivos.

La necesidad de entender procesos físicos y fisiológicos, en el hongo, en la planta y en el medio circundante, son los principales limitantes en el desarrollo de la propuesta; además, lo actual del mecanismo propuesto limita las fuentes referenciales pues el marco conceptual es propio del grupo, por tanto al final se presenta una bibliografía que permitirá al lector interesado profundizar en el tema tratado.

El artículo está dividido en cuatro secciones. En la primera se hace una presentación del marco de referencia teórico. En la segunda parte se presenta una descripción del producto, con énfasis en el efecto de disrupción sobre algunos patógenos en cultivos de flores. En la tercera sección se presenta un resumen de los trabajos sobre seis fitopatógenos, a escala controlada en laboratorio e invernadero. En la última sección se exponen las conclusiones, las recomendaciones y el trabajo futuro.

1. Choque osmótico y bioprotección

Todas las definiciones y teoría expuestas a continuación están enmarcadas respecto al concepto de bioprotección, en la relación planta:patógeno.

Para comenzar, se define el “choque osmótico” como el cambio repentino en la concentración de solutos alrededor de la célula fúngica, que la lleva a su destrucción por plasmólisis. Paralelamente, se define la “tonificación celular” como la ganancia de turgencia, por parte de la célula vegetal, gracias a cambios en su potencial hídrico.

Para poner en contexto técnico, es importante recordar los conceptos de potencial hídrico, plasmólisis versus turgencia y las diferencias en las composiciones de las paredes celulares de plantas y patógenos.

1.1. El Potencial Hídrico (Y)

La movilidad de las moléculas de agua depende de la cantidad de energía libre que tengan o energía total, que es aquella que puede convertirse en trabajo. La cantidad de energía libre de una masa de agua está definida como el potencial hídrico (Ψ). El agua se mueve de sitios de más energía libre a sitios de menos energía libre. Es decir, el agua se traslada de regiones con alto potencial hídrico hacia regiones con bajo potencial hídrico. Una masa de agua pura, sin interacciones con otros cuerpos y a presión normal, tiene un potencial hídrico Ψ=0, luego no presenta movimiento. La concentración de solutos en un medio baja su potencial hídrico y causa migración del agua en esa dirección.

1.2. Plasmólisis versus Turgencia

Dos medios con igual concentración de solutos –sustancias disueltas– se conocen como medios isotónicos, pues tienen el mismo potencial hídrico y en ellos el agua no tendrá preferencia por acumularse en dirección alguna. El medio hipertónico es aquel que tiene mayor contenido de solutos afuera de la célula y por tanto menor potencial hídrico, por tanto el agua emigra de la célula y si el proceso es persistente ésta morirá deshidratada o por plasmólisis. El medio hipotónico es la situación inversa a la anterior, en cuyo caso la célula gana agua, sobrevive, se tonifica y se presenta el fenómeno de turgencia. Como se definió anteriormente, los efectos de disrupción por choque osmótico y de tonificación por aumento de turgencia, califican como bioprotector al producto Forwin®, véase la Figura 1.

Figura 1. Medios isotónico, hipotónico e hipertónico.

control-hongos-figura01

 

1.3. Las paredes Celulares de Hongos y Vegetales

La pared celular típica de un hongo superior está compuesta en mayoría por polisacáridos –entre los que sobresalen la quitina, el quitosano, los glucanos y los mananos– y proteínas. Por su parte,  la pared celular de los vegetales está conformada fundamentalmente por celulosa y cementada con lignina. Por su diferencia estructural, todo clase de soluto no tiene la facultad de atravesar, de forma expedita, ambos tipos de pared celular y es este uno de los principios de la disrupción en la bioprotección de plantas. Ambos tipos de pared celular se construyen por polimerización, gracias a la acción de las Liasas, unos tipos de proteínas específicas presentes en sus plasmalemas.

Los hongos son organismos heterotróficos y se alimentan por absorción, previa digestión externa por excreción enzimática. La célula vegetal del mesófilo es autotrófica ya que produce su propio alimento orgánico por fotosíntesis. De esta forma los monómeros que se usarán para la formación de la pared celular se obtendrán por parasitismo en los patógenos o por fotosíntesis en la planta. Los parásitos obligados deben mantener la integridad celular de su hospedante por medio de efectores (toxinas) y los facultativos deben destruir las células hospederas mediante actividad enzimática (celulasas).

2. El mecanismo de acción de Forwin®

A partir de carbohidratos ácidos –una clase de moléculas necesarias para lo formación de tejidos en las plantas–, se obtiene el principio activo de Forwin® que son los azúcares fosfatados. El proceso biotecnológico de extracción de estas moléculas es la fermentación enzimática controlada, con el concurso de microorganismos cuidadosamente seleccionados por la empresa Biogen Agro.

El resultado es la creación de una nanomolécula, más específicamente una Molécula Activa Disruptora (MAD), en la que los azúcares ácidos se fusionan por fuerzas de Van der Waals junto al ácido urónico, la unidad biomolecular se logra por péptidos de señalización y su rigidez se garantiza por la estructura electroquímica que ofrecen los cofactores fósforo y potasio (ver Figura 2).

Figura 2. Forwin® y su nanomolécula o Molécula Activa Disruptora (izquierda) y su efecto disruptor (derecha). Los azúcares ácidos y los ácidos urónicos se unen por fuerzas de Van der Waals, mientras que los péptidos de señalización (rojo) mantienen la unidad biomolecular. En el centro los cofactores fósforo (verde) y potasio (azul) dan la estructura electroquímica rígida a la MAD.

control-hongos-figura02

El efecto disruptor se da en el proceso de patogénesis por dos grupos de reacciones importantes: (1) la disrupción de membrana por choque osmótico y (2) por destrucción de Liasas en la membrana celular del fitopatógeno.

2.1. Reacciones por Choque Osmótico y Turgencia

El primer grupo de reacción se da por la capacidad que tiene la MAD de penetrar de forma inmediata en la célula vegetal a través de la capa de celulosa de su pared, mientras que no puede atravesar rápidamente la capa de quitina de la pared celular del hongo. Entonces, quedando Forwin® en la zona de infección, el principio activo penetra en la célula vegetal, creándole un medio externo hipotónico, generando turgencia y estímulo. Por otro lado, Forwin®, por su incapacidad de atravesar rápido la pared fúngica, crea un medio externo hipertónico con respecto a la célula del hongo, produciéndole plasmólisis, disrupción de membrana e implosión celular, en cuestión de horas después de ser aplicado (ver Figura 3).

Figura 3. Mecanismo de acción de Forwin® por diferencial estructural en la pared celular. El azúcar fosfatado en forma de nanomolécula (MAD) atraviesa la pared vegetal de forma rápida, pero no así la pared fúngica

control-hongos-figura03

Debido a su mecanismo de acción, Forwin® tiene efecto curativo con respecto al patógeno, es translaminar y de acción rápida. Por lo anterior, la cobertura en la aplicación es un factor importante en el éxito del producto, así como el uso de un buen coadyuvante. La dosis varía de acuerdo al patógeno objetivo, siendo más bajas las dosis en hongos asociados a condiciones secas.

Las hifas, esporas y demás estructuras de hongos asociados a condiciones secas o semi-húmedas, tienen bajos potenciales hídricos. Tal es el caso de los mildeos polvosos (Oidium sp.) y de la mayoría de los géneros Alternaria y Cladosporium. A más bajo potencial hídrico del microorganismo, menor será la dosis necesaria del disruptor para plasmolizarlo. Lo anterior implica que para hongos como Podosphaera pannosa la actividad disruptora es máxima y a dosis de 1.0 cc/L de agua, mientras que para hongos asociados a mayor humedad como Botrytis, con más alto potencial hídrico, se necesitarán dosis superiores del orden de 2.0 a 4.0 cc/L.

La capacidad xerofílica –o facultad de crecer y reproducirse en medios con déficit fuerte de agua–, para la mayoría de hongos se debe a la presencia de polioles (manitol, sorbitol, entre otros) en el interior de sus estructuras. Los hongos xerofílicos (mildeos polvosos en su mayoría) requieren de un potencial hídrico mínimo para crecimiento del orden de -14,5 MPa. Los hongos xerófobos –aquellos que requieren alta humedad–, necesitan potenciales hídricos para su desarrollo y reproducción del orden de -4,2 MPa o superiores. Hongos con mínimos de crecimiento y reproducción entre -14,5 MPa y -4,2 MPa se definen como xerotolerantes. Es bueno recordar que el suelo no salino tiene capacidad de campo promedio de -0,01 a -0,03 MPa y que el punto de marchitez permanente se da hacia los -1,5 Mpa, de esto se tiene que los microorganismos capturan y administran el agua de forma más eficiente que las plantas. Los Oomycetes tienen potenciales hídricos más altos que los hongos superiores, por lo que esta estrategia de control por choque osmótico los hace sensibles sólo a dosis altas.

2.2. Destrucción de Liasas en el Fitopatógeno

La Molécula Activa Disruptora penetra más lento en la célula del microorganismo causal de la enfermedad. La presencia de los MAD’s en el patógeno induce un desbalance electroquímico entre su membrana celular y su citoplasma. Al ser atacados enzimáticamente, cada MAD libera dos moléculas de ácido urónico que destruye las Liasas del patógeno, quedando éste imposibilitado para restituir o producir nueva pared celular (Figura 2, imagen derecha).

3. Resultados en Medio Controlado

En esta sección se presenta un resumen del desarrollo de producto a nivel de invernadero y laboratorio, en condiciones controladas de humedad relativa (>90%) y temperatura (20 a 22°C), con el apoyo de la empresa SAVE consultores. En la Tabla 1 se presentan los resultados en porcentaje de control con respecto al testigo absoluto sin aplicación, usando la fórmula de Henderson & Tilton. Este resumen corresponde a investigaciones llevadas a cabo en Colombia, desde el año 2014 hasta comienzos de 2016.

control-hongos-tabla01

De acuerdo con la Tabla 1 y la Figura 4, para las condiciones de los ensayos, los hongos xerofílicos y los xerotolerantes fuertes son candidatos a la inclusión de Forwin® en los programas de rotación, pues su control es eficiente desde bajas dosis (P. Pannosa y C. equinulatum). En el caso especial de P. Pannosa, se notó una ligera recuperación del hongo en la dosis de 0,5 cc/L, por lo que esta concentración no se recomienda. El efecto de disrupción por plasmólisis puede detallarse en las imágenes secuenciales y por dosis que aparecen en la Figura 5.

Un segundo grupo potencial para control por choque osmótico y disfunción de Liasas es el de los hongos xerotolerantes débiles, representado por B. cinerea.

Claramente, un control eficiente requiere de la dosis más alta de 4,0 cc/L, o de 4 litros por hectárea. En esta posición se ubicó igualmente la especie Alternaria sp. que, aunque siendo xerotolerante fuerte, se comportó como un xerotolerante débil respecto a la plasmólisis inducida por Forwin® (Figura 4).

Figura 4. Choque osmótico inducido por Forwin®

control-hongos-figura04

El tercer grupo se da en los patógenos xerofóbicos como el hongo Itersonilia sp. y el Oomyceto P. Sparsa, que claramente tienen un comportamiento diferente con los dos primeros grupos.

Conclusiones, Recomendaciones y Trabajo Futuro

Con los resultados obtenidos en la fase de trabajo a nivel controlado en invernadero y laboratorio, se puede concluir que Forwin® representa una herramienta apropiada para el manejo de hongos xerofílicos (P. pannosa) y xerotolerantes fuertes (Cladosporium sp. y Alternaria sp.), pues requieren dosis bajas para su control, lo cual asegura un costo:beneficio favorable para su implementación. Es claro que las dosis son incrementales acorde con la fisiología de cada patógeno, siendo éstas medias para hongos xerotolerantes débiles (Botrytis sp.) y altas para microorganismos xerofóbicos como mildeos vellosos (P. sparsa) y algunos basidiomicetos (Itersonilia sp.).

La empresa Talex – Colombia y Biogen Agro de Perú recomiendan el uso de Forwin® en dosis de 2,0 cc/L para el control de hongos xerofílicos (P. Pannosa) y xerotolerantes fuertes (C. echinulatum y Alternaria sp). El uso en hongos xerotolerantes débiles como Botrytis sp. deberá hacerse valorando el riesgo del daño; es decir, tanto la probabilidad que aparezca el patógeno como el impacto que pueda generar sobre todo en reclamos postventa de las flores, decidiendo su uso si la dosis de 4,0 cc/L ofrece un beneficio económico razonable para el floricultor.

El trabajo futuro, en primera medida, está en evaluar el efecto estimulante de Forwin® en la planta, lo cual se viene implementando en algunos grupos de floricultores. Este trabajo permitirá a Talex – Colombia validar en cada grupo el efecto bioprotector y confirmar in situ que Forwin® es deletéreo para el patógeno, por daño directo mediante choque osmótico y destrucción de Liasas, y benéfico para la planta por tonificación y efecto estimulante. El segundo trabajo futuro está en la formación de posgraduados en fitopatología y fisiología vegetal, para estimar los parámetros de potenciales hídricos para cada relación patógeno:cultivo, con el objetivo de optimizar el uso del producto, incluso a nivel de razas y microclimas.

Figura 5. Seguimiento microscópico del control por plasmólisis y disfunción de Liasas para Forwin®. Primera fila, testigo; segunda fila 0.5 cc/L; tercera fila 1.0 cc/L; cuarta fila 2.0 cc/L; quinta fila 4.0 cc/L. Las columnas representan de izquierda a derecha los tiempos: 4 horas, 24 horas, 48 horas y 72 horas después de aplicado.

control-hongos-figura05

Agradecimientos

Talex – Colombia y Biogen Agro de Perú agradecen a SAVE consultores por su apoyo en el montaje de las trabajos en condición controlada. Igualmente a la empresa Agrobiol SAS, por su apoyo estratégico en el desarrollo de la propuesta en el sector de la floricultura Colombiana.


Bibliografía

  • Alberts, B. et al. (2008). Molecular Biology of the Cell, 5 ed. New York: Garland Science.
  • Jenning, D. H. (1995). The Physiology of Fungal Nutrition. London: Cambridge University Press.
  • Michiels et al. (2008). High Pressure Microbiology. Washington: ASM-Press.
  • Nobel, P. (2009). Physicochemical and Environmental Plant Physiology, 4 ed. New York: Elsevier Academic Press.
  • Pontón, J. (2008). La pared celular de los hongos y el mecanismo de acción de la anidulafungina. In: Rewiev of Iberoamerican Micology. 25: 78-82.
  • Sánchez-Rodriguez, C. et al. (2009). The ERECTA Receptor-Like Kinase Regulates Cell Wall–Mediated Resistance to Pathogens in Arabidopsis thaliana. In: American Phytopathologycal Society. 22(8): 953-963.
  • Webster, J. and Weber, R. (2007). Introduction to Fungi. London: Cambridge University Press.